تکنیک الایزا (ELISA) چیست؟

آزمایش الایزا تکنیکی است که برای تشخیص وجود آنتی ژن در نمونه های بیولوژیکی مورد استفاده قرار می گیرد. این تست یکی از آزمایشات تخصصی است که در آزمایشگاه های تشخیص طبی و آزمایشگاه های تحقیقاتی برای تشخیص بیماری های خونی ویروسی یا شناسایی سایر انواع پروتئین های خونی مورد استفاده قرار می گیرد.

ELISA مخفف عبارت "Anzyme-linked immunosorbent assay" یا ارزیابی جذب ایمنی با واسطه واکنش آنزیمی است. برای اولین بار در سال 1974، P. Perlmann و E. Engvall این آزمایش را به عنوان جایگزینی برای برخی از آزمایشات رادیو ایمونواسی پیشنهاد دادند و در نهایت، این آزمایش جایگزین تست وسترن بلات (که فرآیند دشوار آن یکی از معضلات پیش روی تشخیص بود) و به عنوان یک تست روتین آزمایشگاهی و راه تشخیص بیماری های موجود در خون (از نوع عفونی) مورد استفاده قرار گرفت. تست الایزا کارایی بسیار بالایی دارد و بسیاری از کیت های تشخیصی آن به صورت تجاری در دسترس هستند.

تست الایزا چگونه عمل می کند؟

آزمایش الایزا از ترکیب اجزای سیستم ایمنی (مانند آنتی بادی های IgG یا IgM) و مواد شیمیایی (مانند آنزیم ها) برای تشخیص وجود بیماری خونی ویروسی یا میکروبی و همچنین برخی از پروتئین های بدن (مانند هورمون ها) بهره می برد.

به طور کلی، در روش الایزا، آنتی ژن (که همان ماده پروتئینی مورد نظر است) بر روی یک سطح جامد تثبیت می شود. این کار به طور مستقیم یا از طریق استفاده از یک آنتی بادی که خود روی سطح جامد تثبیت شده است، انجام می شود. در مرحله بعد این آنتی ژن تثبیت شده با روش های رنگ سنجی مورد بررسی قرار می گیرد.

انواع تست الایزا

در این آزمایش یک صفحه میکروتیتر جامد وجود دارد که نوعی از مولکول ها بر روی آن تثبیت شده است و این مولکول براساس نوع تست الایزا متفاوت است. به طور کلی، چهار نوع اصلی الایزا وجود دارد: الایزای مستقیم، الایزای غیرمستقیم، الایزای ساندویچی و الایزای رقابتی که هر کدام مزایا، معایب و مناسبت منحصر به فردی دارند که در اینجا به توضیح این موارد خواهیم پرداخت:

1.   الایزای مستقیم:

در این روش آنتی ژن های موجود در نمونه بر روی صفحه میکروتیتر تثبیت شده و سپس آنتی بادی اختصاصی مربوط به آنتی ژن به آن اضافه می شود. این آنتی بادی به آنزیم تولید کننده رنگ متصل بوده و اتصال آن به آنتی ژن می تواند در تشخیص آن موثر واقع شود.

•   مزایای این روش: صرفه جویی در زمان و معرف ها و عدم وجود احتمال واکنش متقاطع ناشی از آنتی بادی ثانویه؛

•   معایب این روش: انعطاف پذیری کمی دارد زیرا که آنتی بادی اولیه باید کونژوگه شود. سیگنال آن تقویت نشده است. تمام پروتئین های نمونه به سطح متصل می شوند.

2.   الایزای غیرمستقیم:

در این روش انجام تست الایزا، پروتئین هدف یا آنتی ژن با غلظت مشخصی روی صفحه میکروتیتر تثبیت شده است. هنگامی که نمونه بیمار به این صفحه اضافه می شود، در صورتی که آنتی بادی علیه پروتئین هدف در داخل نمونه بیمار وجود داشته باشد، این آنتی بادی ها به آنتی ژن متصل می شوند. در مرحله بعد آنتی بادی متصل به آنزیم تولید کننده رنگ به نمونه افزوده می شود که نتیجه آن تولید رنگ است. بیشتر تست های مورد استفاده در تشخیص بیماری های خونی میکروبی از این دسته تست ها هستند.

•   مزایای این روش: تقویت سیگنال رنگ به دلیل امکان اتصال چند آنتی بادی ثانویه به آنتی بادی اولیه، انعطاف پذیری بالا که به دلیل امکان استفاده از یک آنتی بادی ثانویه برای چندین آنتی بادی اولیه است؛

•   معایب این روش: روش انجام طولانی در مقایسه با الایزای مستقیم، واکنش متقاطع بالقوه ناشی از آنتی بادی ثانویه

3.   الایزای ساندویچی:

روش الایزای ساندویچی رایج ترین روش تشخیصی برپایه الایزا است که در آزمایشگاه های تشخیص طبی مورد استفاده قرار می گیرد. در این روش نیز مانند روش غیرمستقیم به دو آنتی بادی خاص برای شناسایی آنتی ژن های مختلف نیاز داریم. این دو آنتی بادی معمولاً به عنوان جفت آنتی بادی منطبق شناخته می شوند. یکی از آنتی بادی ها روی سطح صفحه میکروتیتر تثبیت شده است و برای به دام انداختن و تثبیت آنتی ژن موجود در خون مورد استفاده قرار می گیرد. آنتی بادی دوم به آنزیم تولید کننده رنگ متصل است و در تشخیص نهایی وجود آنتی ژن نقش دارد. به عبارت دیگر، در این روش آنتی ژن در بین دو آنتی بادی اول و دوم به دام می افتد و به همین دلیل به این روش، روش ساندویچی گفته می شود.

•   مزایای این روش: اختصاصیت بسیار بالا به دلیل شناسایی یک آنتی ژن با دو آنتی بادی اختصاصی، مناسب برای نمونه های پیچیده و حاوی آنتی ژن های متعدد، انعطاف پذیری و حساسیت بالا؛

•   معایب این روش: نیازمند طراحی دقیق برای یافتن دو آنتی بادی علیه یک هدف است که به خوبی با هم کار می کنند. این طراحی ممکن است که گاهی اوقات چالش برانگیز باشد.

4.   الایزای رقابتی:

این روش به عنوان الایزای مهاری نیز شناخته می شود و طی آن، آنتی ژن های خاص در نمونه برای اتصال به مقدار خاصی از آنتی بادی نشاندار شده، با آنتی ژن مرجع رقابت می کنند. ابتدا نمونه حاوی آنتی ژن به آنتی بادی های اختصاصی تثبیت شده بر روز میکروتیتر افزوده می شود. در مرحله بعد، بسته به مقدار آنتی ژن موجود در نمونه، آنتی بادی های کم و بیش آزاد برای اتصال آنتی ژن مرجع در دسترس خواهند بود. این بدان معنی است که هر چه آنتی ژن در نمونه بیشتر باشد، آنتی ژن مرجع کمتری به آنتی بادی ها متصل شده و شناسایی می شود و سیگنال مرجع ضعیف تر خواهد بود. این مساله به صورت برعکس هم صادق خواهد بود.

برخی از کیت های رقابتی الایزا از آنتی ژن نشاندار به جای آنتی بادی نشاندار استفاده می کنند. آنتی ژن نشاندار شده و آنتی ژن نمونه (بدون برچسب) برای اتصال به آنتی بادی اولیه با هم رقابت می کنند. هر چه مقدار آنتی ژن در نمونه کمتر باشد، از آنجایی که آنتی ژن نشاندار بیشتری در چاهک وجود دارد، سیگنال قوی تری توسط دستگاه ایجاد می شود.

•   مزایای این روش: برای آنتی ژن های کوچک مناسب است؛

•   معایب این روش: انتخاب صحیح آنتی ژن مرجع بسیار اهمیت دارد.

کیت الایزا یک آزمایش الایزا است که به صورت تجاری و آماده مصرف تهیه شده است که معمولاً حاوی صفحات میکروتیر از جنس پلی استایرن است که ماده تشخیصی مورد نظر از قبل بر روی آن تثبیت شده است.

مزایا و معایب آزمایش الایزا

مزایا:

1.   حساسیت و اختصاصیت بالا: این تست به دلیل استفاده از مولکول های آنتی بادی که دقت بالایی دارند، امکان تشخیص آنتی ژن ها در سطح پیکوگرم را دارد؛

2.   امکان آنالیز همزمان چندین نمونه به صورت همزمان: کیت های تجاری الایزا معمولاً در قالب صفحه 96 چاهی موجود هستند. اما سنجش را می توان به راحتی با صفحات 384 چاهی نیز انجام داد که هر چاهک مخصوص یک بیمار است؛

3.   روش انجام آسان؛

4.   امکان انجام به دو صورت کمی و کیفی وجود دارد؛

5.   امکان آزمایش انواع مختلف نمونه: سرم، پلاسما، عصاره های سلولی و بافتی، ادرار و بزاق و غیره.

معایب:

1.   تشخیص بر اساس واکنش های رنگی آنزیم/سوبسترا است و بنابراین برای خواندن زمان تست تنها یک بازه زمانی کوتاه در اختیار داریم؛

2.   دریافت اطلاعات محدود به مقدار یا حضور آنتی ژن در نمونه است.

تفسیر تست الایزا

آزمایش الایزا شامل استفاده از یک آنزیم، یک آنتی بادی و آنتی ژن می شود. انجام گرفتن واکنش آنتی ژن-آنتی بادی یک نتیجه مثبت و عدم انجام آن یک نتیجه منفی را در پی خواهد داشت. روی دادن و یا روی ندادن واکنش آنتی ژن-آنتی بادی با تولید رنگ در واکنش نهایی مشخص می شود و شدت رنگ نیز می تواند برآوردی از میزان وجود آنتی ژن یا آنتی بادی هدف در نمونه را برای ما مشخص کند.

نمونه‌هایی از کاربردهای آزمایش الایزا شامل تشخیص عفونت‌هایی مانند HIV (ویروس نقص ایمنی انسانی) و برخی بیماری‌های آلرژیک مانند آلرژی‌های غذایی و تحقیقات تجربی برای شناسایی ترکیبات (آنتی‌ژن‌های لیزات سلولی در طیف وسیعی از ارگانیسم‌ها) است. آزمایش‌های الایزا در درجه اول پروتئین‌ها را شناسایی می‌کنند و ارگانیسم هایی که توسط تست های الایزا شناسایی می شوند می توانند شامل هورمون ها (هورمون گنادوتروپین جفتی انسانی (HCG))، آلرژن ها (ترکیباتی که باعث بروز واکنش آلرژیک می شوند)، آنتی ژن های ویروسی (مثلاً تب دنگی)، آنتی ژن های باکتریایی (مثلاً سل)، و آنتی بادی هایی باشند که بدن در پاسخ به عفونت ساخته است (مثل آنتی بادی های هپاتیت B).

7 نکته برای آزمایش الایزای موفقیت آمیز

-   ترکیب کردن مناسب و یکنواخت محتویات چاهک ها با اینکه ممکن است که کاری ساده به نظر برسد، اما نقش مهمی در دستیابی به یک نتیجه دقیق و صحیح دارد. زیرا باعث پخش شدن مناسب آنتی ژن، آنتی بادی و رنگ در همه جای چاهک شده و اطمینان از وجود آنتی ژن (و مقدار دقیق آن در نمونه) را افزایش می دهد؛

-   در هر ران کاری از کنترل های مثبت و منفی استفاده کنید. اینکار باعث می شود که از صحت عملکرد خود و عدم آلودگی ترکیبات مورد استفاده در تست اطمینان حاصل کنید. سعی کنید که منحنی استاندارد را برای هر ران کاری به صورت جداگانه رسم کنید؛

-   همه ترکیبات کیت را تقریباً 30 دقیقه قبل از شروع کار در دمای اتاق قرار دهید. بسیاری از ترکیبات حاوی اجزای وابسته به دما هستند که ممکن است در هنگام سرد شدن از محلول خارج شده و وارد واکنش نشوند. بنابراین تغییرات دمایی می تواند بر نتیجه تست شما تأثیر بگذارد؛

-   احتمال آلودگی ترکیبات را به حداقل برسانید. تعویض مداوم سر پیپت ها، عدم استفاده از پیپت های آلوده و عدم استفاده از ظرف اصلی محلول ها برای افزودن ترکیبات تست به چاهک ها می تواند مانع از آلودگی ترکیبات شده و صحت کار ما را افزایش دهد؛

-   برای اطمینان از اینکه روش شما به خوبی کار می کند و امکان عیب یابی مناسب در صورت بروز مشکل، وجود دارد، نتایج مربوط به کنترل های مثبت و منفی و منحنی های استاندارد خود را در محلی مطمئن نگهداری کنید؛

-   از رقیق کننده ها و بافرهای هر کیت برای خودش استفاده کنید. برای دستیابی به بهترین نتایج، لازم است که از رقیق کننده ها و بافرهای شست و شوی توصیه شده توسط شرکت سازنده استفاده کنید. نوع مواد شوینده، قدرت یونی، pH و غیره همگی می‌توانند نقش مهمی در نتایج تست شما داشته باشند؛

-   زمان، دما و شرایط توصیه شده برای انکوباسیون را رعایت کنید. اگر زمان کافی برای اینکار ندارید یا نمیتوانید دمای مناسب را تامین کنید، تا حد امکان از انجام تست خودداری کنید.