توالی یابی DNA چیست و چه کاربردی در پزشکی و تحقیقات علمی دارد ؟
ماده ژنتیکی بدن ما از ملکولی به نام DNA ساخته شده است که شامل 4 نوع باز آلی می باشد. به ترتیب قرار گیری این بازها در کنار یکدیگر، توالی DNA گفته می شود. گاهی در اثر برخی وقایع مانند جهش، بازهای آلی دچار تغییر می گردند. بروز هرگونه جهش یا تغییر در توالی ماده ژنتیکی، ممکن است سبب به وجود آمدن اختلال و بروز بیماری شود. امکان خوانش و تشخیص جهش های ژنتیکی به کمک روش توالی یابی DNA و با استفاده از تجهیزات آزمایشگاهی فراهم شده است. این موضوع در زمینه بررسی علت و تشخیص و درمان بیماری ها اهمیت ویژه ای دارد.
نتایج به دست آمده از توالی یابی DNA برای محققانی که عملکرد ژن ها را بررسی می کنند، بسیار مهم است. زیرا این اطلاعات کاربرد زیادی در پزشکی قانونی، تشخیص های بالینی و ویروس شناسی دارند. به عنوان مثال، استفاده از این روش، یک ابزار تشخیصی در پزشکی برای بیماران سرطانی است که نوع سرطان را شناسایی می کند و به پزشک این امکان را می دهد که با توجه به نوع بیماری، بهترین روش درمانی را به کار گیرد. از سوی دیگر در زیست شناسی مولکولی، توالی یابی DNA یا سکانس، به عنوان بخش جدایی ناپذیر از اکثر آزمایشگاه های بیولوژیکی است که برای تأیید نتایج آزمایشات مورد استفاده قرار می گیرد.
انواع روش های توالی یابی یا سکانس DNA
به طور کلی انواع مختلفی از روش های توالی یابی یا سکانس وجود دارند که به دو گروه توالی یابی نسل اول (سنگر) و توالی یابی های نسل دوم (NGS) تقسیم می شوند.
• توالی یابی نسل اول
توالی یابی به روش سنگر یا روش ختم زنجیره، تکنیکی است که برای خوانش کل کروموزوم ها یا رشته های طولانی DNA با بیش از 1000 جفت باز طراحی شده است. این روش توسط بیوشیمیدان بریتانیایی فردریک سنگر و همکارانش در سال 1977 ابداع شد. اساس توالی یابی سنگر، استفاده از دی دئوکسی نوکلئوتید هایی است که در تکثیر DNA مورد استفاده قرار می گیرند، این نوکلئوتید ها فاقد گروه هیدروکسیل 3 پریم هستند که برای گسترش 5 پریم تا 3 پریم زنجیره پلی نوکلئوتیدی DNA مورد نیاز است.
با مخلوط کردن ddNTP هایی که با رنگ های متفاوت برای هر پایه، dNTP های بدون برچسب و DNA الگو در یک واکنش مبتنی بر پلیمراز برچسب گذاری شده اند، رشته هایی با هر طول توالی، زمانی که ddNTP ها به طور تصادفی ترکیب شده و زنجیره را خاتمه می دهند، تولید می شوند. سپس محصولات با طول متفاوت از طریق الکتروفورز جدا سازی می شوند.
در توالی یابی به روش سنگر قطعات تولید شده توسط برچسب های فلورسنتی که به آنها متصل است، شناسایی شده و هر رنگی نمایانگر یک ddNTP خواهد بود. بنابراین با تجزیه و تحلیل داده ها می توان توالی رشته DNA الگو را به دست آورد. این روش به طور گسترده ای برای پیشبرد زمینه ژنومیک عملکردی و مقایسه ای، ژنتیک تکاملی و تحقیقات بیماری های پیچیده مورد استفاده قرار گرفته است. شایان ذکر است، روش دی دئوکسی در تعیین توالی اولین ژنوم انسان در سال 2002 به کار گرفته شد. به دلیل مناسب بودن آن برای اعتبارسنجی معمول آزمایشات کلونینگ و قطعات حاصل از PCR، توالی یابی سنگر یک تکنیک محبوب در بسیاری از آزمایشگاه ها در سراسر جهان است. توالی یابی به روش سنگر مزایا و کاربردهای متعددی دارد که عبارتند از:
o هدف قرار دادن مناطق ژنومی کوچکتر در تعداد بیشتری از نمونه ها
o توالی یابی یا سکانس نواحی متغیر (variable regions)
o تایید نتایج حاصل از مطالعات توالی یابی نسل بعدی (NGS)
o بررسی توالی های پلاسمیدی، جهش ها
o ژنوتیپ نشانگرهای ریز ماهواره (Microsatellite genotyping)
o شناسایی انواع ژنتیکی منفرد عامل بیماری (واریانت های ژنتیکی)
مواد مورد استفاده در توالی یابی سنگر
در تکنیک سنگر، جهت انجام سکانس لازم است که ناحیه مورد نظر توسط روش PCR تکثیر شده و بعد خوانش انجام شود که این موضوع یکی از تفاوت های مهم بین توالی یابی به روش سنگر و روش NGS است. در این تکنیک مواد مختلفی مورد نیاز است که عبارتند از:
• آنزیم DNA پلیمراز
• چهار نوع نوکلئوتید dGTP، dCTP، dTTP، dATP و دی دئوکسی نوکلئوتیدهای نشان دار (هر نوع نوکلئوتید رنگ منحصر به فرد و متفاوت خود را دارد)
• پرایمر
• نمونه ای که خوانش باید روی آن صورت گیرد.
نحوه عملکرد توالی یابی سنگر
در مرحله اول، نمونه ای که باید توالی یابی گردد به لوله ای که شامل پرایمر، آنزیم DNA پلیمراز و نوکلئوتیدها است، اضافه می گردد. سپس چهار نوع دی دئوکسی نوکلئوتید خاتمه دهنده زنجیره که هر یک با رنگ خاصی نشان دار شده اند هم به این محتویات اضافه می شوند، اما مقدار آنها بسیار کمتر از نوکلئوتید های معمولی است.
در مرحله بعد جهت دناتوره کردن رشته های DNA نمونه و تک رشته ای کردن آنها، حرارت داده می شود مرحله. (Denaturation) سپس دمای واکنش کاهش می یابد مرحله (Annealing) تا پرایمر بتواند به رشته الگوی تک رشته ای متصل گردد. پس از اتصال پرایمر، دما مجدداً بالا رفته و به DNA پلیمراز اجازه می‌دهد تا DNA جدیدی را با شروع از پرایمر سنتز کند مرحله. (Extention)
برای ادامه ی فرایند توالی یابی، DNA پلیمراز به افزودن نوکلئوتیدها به زنجیره ادامه می دهد تا زمانی که به جای یک نوکلئوتید معمولی، یک نوکلئوتید دی دئوکسی اضافه شود. در آن نقطه، هیچ نوکلئوتید دیگری نمی تواند اضافه شود، بنابراین رشته با دی اکسی نوکلئوتید به پایان می رسد.
این فرآیند در چند چرخه تکرار می شود. تا زمانی که چرخه کامل گردد، و تضمین می شود که یک نوکلئوتید دی دئوکسی در هر موقعیت تکی از DNA هدف حداقل در یک واکنش گنجانده شده و لوله حاوی قطعاتی با طول های مختلف است که به هر یک از موقعیت های نوکلئوتیدی در DNA اصلی ختم می شود.
پس از اتمام واکنش، قطعات از یک لوله موئینه حاوی ژل در فرآیندی به نام الکتروفورز ژل مویرگی عبور داده می شوند. قطعات کوتاه به سرعت در منافذ ژل حرکت می کنند، در حالی که قطعات بلند این مسیر را آهسته تر می گذرانند. هر قطعه ای که از لوله موئینه خارج می شود، اشعه لیزر به آن تابیده و دی دئوکسی نوکلئوتید انتهای نشاند دار شناسایی می شود. در توالی یابی به روش سنگر، نوکلئوتید ها یکی پس از دیگری در آشکارساز (detector) ثبت شده و می توان توالی یا سکانس قطعه اصلی DNA را بدست آورد. داده های ثبت شده توسط آشکارساز شامل یک سری پیک در شدت فلورسانس است که نمایان گر توالی نوکلئوتید های نمونه می باشند.
• توالی یابی نسل دوم (NGS)
توالی یابی نسل بعدی(Next Generation Sequencing) (NGS)، نوعی روش خوانش برای تعیین توالی DNA یا RNA برای مطالعه تغییرات ژنتیکی مرتبط با بیماری ها یا سایر پدیده های بیولوژیکی می باشد. این روش که در سال 2005 برای استفاده تجاری معرفی شد، در ابتدا با نام «توالی یابی موازی گسترده» (massively parallel sequencing) یا MPS وارد بازار شد، چون امکان سکانس یا خوانش بسیاری از رشته های DNA را به طور همزمان با الکتروفورز مویرگی(CE) فراهم می کرد.
هر یک از این فناوری ها در زمینه تجزیه و تحلیل ژنتیکی در تحقیقات علمی کاربرد دارند. به عنوان مثال روش سنگر برای تجزیه و تحلیل تعداد کمی از اهداف و نمونه های ژنی بهترین گزینه است و می تواند در یک روز انجام شود. در صورتی که برای توالی یابی صدها تا هزاران ژن را در یک زمان، انجام روش NGS توصیه می شود.