PCR چیست و چه نقشی در علوم پزشکی و تحقیقات علمی دارد؟

PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز) روش آزمایشگاهی بسیار رایجی برای تکثیر اسیدهای نوکلئیک می باشد. این تکنیک بسیار سریع و دقیق بوده و با تکثیر هدفمند، قادر به شناسایی جهش ها یا تغییرات ژنتیکی می باشد. امروزه واکنش های زنجیره ای پلیمراز به عنوان کارآمدترین روش در آزمایشگاه های تشخیصی، تحقیقاتی و مولکولی-صنعتی مطرح است.

انواع PCR

واکنش های زنجیره ای پلیمراز براساس اینکه چه ماده زیستی را مورد بررسی قرار می دهند و همچنین روشی که برای تکثیر از آن استفاده می کنند، به گروه های مختلفی طبقه بندی می شوند:

• تکثیر و بررسی DNA : در اغلب موارد از این روش برای تکثیر هدفمند DNA و بررسی تغییرات ژنتیکی در آن استفاده می شود.
• تجزیه و تحلیل RNA : RNA یکی از انواع اسیدهای نوکلئیک است که حاوی اطلاعاتی است که از DNA کپی شده و در ساخت پروتئین ها نقش دارد. بنابراین در مطالعات بررسی کمی بیان ژن توسط PCR معمول تر است، هر چند که برخی ویروس های مبتنی بر RNA (مانند ویروس HIV) نیز با این نوع روش ها قابل بررسی هستند.

همانگونه که پیش تر توضیح داده شد، نوع دیگری از دسته بندی روش های PCR براساس روش انجام تست و نوع مواد مصرفی (مثل استفاده یا عدم استفاده از مواد فلوئورسنت) نیز وجود دارد که شامل:

• Real-Time PCR (PCR کمی یا qPCR) : در این روش مولکول های DNA با استفاده از رنگ فلورسنت نشاندار می شوند و برای بررسی و تعیین کمیت محصولات PCR در لحظه و زمان واقعی مورد استفاده قرار می گیرند.
• ترانس کریپتاز معکوس (RT-PCR) : در این تکنیک، ابتدا رشته مکمل (cDNA) با رونویسی معکوس از RNA به DNA و با استفاده از ترانس کریپتاز معکوس ایجاد شده و سپس تکثیر می شود.
• Multiplex PCR : از تعدادی پرایمر مختلف برای تکثیر چند قطعه در یک نمونه DNA و یک واکنش استفاده می شود.
• Nested PCR : پس از 25-35 چرخه اولیه PCR، یک PCR اضافی با استفاده از پرایمرهای جدید در داخل قطعه تکثیر شده، توسط پرایمرهای اصلی انجام می شود که خطر وجود آلودگی یا محصولات ناخواسته را کاهش می دهد.
• Hot Start PCR : که در آن از گرما برای دناتوره کردن آنتی بادی هایی استفاده می شود که برای غیرفعال کردن آنزیم Taq پلیمراز به کار می روند.
• PCR با قابلیت تکثیر قطعات بزرگ : ناحیه وسیعی از DNA با استفاده از مخلوطی از پلیمرازها تکثیر می شود.
• Assembly PCR : قطعات DNA طولانی تر با استفاده از پرایمرهای دارای همپوشانی تکثیر می شوند.
• PCR نامتقارن : تنها یک رشته از دو رشته DNA هدف تکثیر می شود.
• In situ PCR : بر روی سلول ها یا بافت تثبیت شده روی یک اسلاید انجام می شود.
• TP PCR: از این روش برای تشخیص جهش در بیماران و ناقلین FRDA استفاده می شود.

واکنش های زنجیره ای پلیمراز چگونه انجام می شود؟

اصول کلی انجام تست PCR، صرف نظر از نوع تست و نوع نمونه مورد مطالعه یکسان است. به طور کلی، پنج ماده اصلی برای راه اندازی یک واکنش PCR مورد نیاز است که در ادامه به توضیح هر مورد و عملکرد دقیق آنها خواهیم پرداخت:

• رشته DNA که باید کپی برداری و تکثیر شود.
• پرایمرها یا قطعات کوتاهی از DNA که واکنش PCR را آغاز می کنند و برای اتصال به هر دو طرف بخشی از DNA که لازم است کپی برداری شود، مورد استفاده قرار می گیرند.
• بازهای نوکلئوتیدی DNA (تحت عنوان dNTP شناخته می شود). بازهای DNA (A، C، G و T) واحدهای سازنده DNA هستند و برای ساخت رشته جدید DNA مورد نیاز هستند.
• آنزیم Taq پلیمراز که رشته های جدید DNA را از روی رشته اولیه می سازد.
• مخلوط بافر، برای ایجاد شرایط مناسب واکنش.

به طور کلی، PCR سه مرحله اصلی دارد:

• Denaturation : در این مرحله، DNA الگوی دو رشته ای حرارت داده می شود تا به صورت تک رشته در آید.
• Annealing : دما کاهش می یابد تا پرایمرها به رشته DNA الگو متصل شوند.
• Extension : دما افزایش می یابد و رشته جدید DNA توسط آنزیم Taq polymerase ساخته می شود.

این سه مرحله 20-40 بار تکرار می شود و در هر تکرار، تعداد کپی های DNA دو برابر می شود. در نهایت و پس از تکمیل PCR، می توان از روشی به نام الکتروفورز برای بررسی کمیت و اندازه قطعات DNA تولید شده استفاده کرد.

کاربرد PCR و اهمیت آن در تشخیص بیماری ها چیست؟

آزمایش‌های PCR می‌توانند شواهدی از وجود بیماری در مراحل اولیه، تشخیص عفونت و یا سرطان ها را نمایان سازند. این در حالی است که بسیاری از آزمایش‌های دیگر ممکن است که قادر به تشخیص نشانه‌های اولیه بیماری نباشند، زیرا میزان کافی و یا قابل تشخیصی از ویروس‌ها، باکتری‌ها یا سایر عوامل بیماری‌زا در نمونه وجود ندارد. در مقابل، روش PCR قادر است بیماری را زمانی که فقط مقدار بسیار کمی از عوامل پاتوژن در بدن وجود دارد نیز تشخیص دهد و بنابراین امکان تشخیص زودهنگام و اولیه را فراهم می آورد. علاوه براین، در مواردی که بیمار مشکوک به ابتلا نوعی عفونت ویروسی مانند HIV است، تست PCR می تواند پیش از بروز هرگونه علامتی، وجود مقادیر کم ویروس در خون بیمار را مشخص کند. این مساله در خصوص شناسایی سلول های سرطانی در برخی سرطان ها بسیار حائز اهمیت است.

از دیگر کاربردهای PCR می توان به موارد زیر اشاره نمود:

• تعیین هویت و انگشت نگاری DNA (شناسایی مجرمین در پرونده های قضایی)
• بررسی روابط پدر - فرزندی، مادر - فرزندی
• تشخیص اختلالات ژنتیکی مانند تالاسمی
• ترسیم نقشه های تکامل زیستی و فیلوژنی
• میکروبیولوژی محیطی و شناسایی ارگانیسم های موجود در یک محیط به منظور بررسی های اپیدمیولوژیک
• تشخیص پیش از تولد و تعیین جنسیت جنین
• بررسی های اثربخشی دارویی و ردیابی وجود یا عدم وجود سلول های سرطانی پس از درمان
• بررسی سازگاری ژنتیکی بین فرد اهدا کننده و دریافت کننده پیوند برای کاهش احتمال رد پیوند

به طور کلی، امروزه PCR یکی از روش های تشخیصی اصلی برای برخی از بیماری های ژنتیکی مانند تالاسمی، فیبروز کیستیک، نقص فاکتورهای انعقادی مانند آنتی ترومبین و فاکتور ون ویلبراند، نقص های آنزیمی مانند نقص G6PD و HGPRT، و همچنین بیماری های متابولیکی مانند فنیل کتونوریا و تی ساکس با شیوع نسبتا بالا است و پیشرفت های روزافزون در زمینه بهبود روند انجام تست و به وجود آمدن روش های PCR جدید توانسته است که هر روز موارد بیشتری را به بیماری های قابل تشخیص با PCR بیفزاید.